1RT-PCR技术
PCR是一种在机体外部迅速扩大增加特定基因或DNA序列的方法,它是由美国科学家Mullis在1983年发明的。RT-PCR是从RNA拷贝扩增cDNA的一种方法,其具体操作过程是:首先反转RNA并录成cDNA,再经过PCR加以扩增,从而使它的敏感性得以有效提高,针对dotblot或Northernblot中含有的目的mRNA不高的问题,这一技术可以有效解决。例如:郑小伟等人为了对二仙汤治疗肾阳虚证的作用机理进行有效的阐释,在各不相同的时间范围内,研究了二仙汤对于患有肾阳虚的大鼠垂体促肾上腺皮质激素基因表达所产生的影响,最终的研究结果表明:二仙汤可以上调垂体组织ACTH的基因表达,而且用药的时间如果被延长,那么其表达量就会得到增加,这可以反映出上调ACTHmRNA表达,是利用二仙汤对肾阳虚证进行治疗的作用机理之一;β地中海贫血是一种具有遗传性和溶血性的贫血病,补肾生血胶囊可以益髓、生血、补肾,对于治疗杂合子患者效果比较显著。为了对其分子机理进行揭示,吴志奎等人利用RT-PCR的相关技术,研究了使用补肾生血胶囊的患者的α、β和γ珠蛋白mRNA转录水平,最终得出的研究结果认为,补肾生血胶囊能够有效地促进患有β地中海贫血的患者血红和抗碱血红蛋白,以及Hb珠蛋白链比的明显增加,相应地升高了γ珠蛋白mRNA转录水平,这表明有关的补肾生血的中药对于γ珠蛋白的转录与表达的促进是非成有力的,而且可以通过诱导促进HbF的合成,同时也代偿了β珠蛋白基因所具有的缺陷。
2DDPCR技术
梁鹏等人于1992年创立了DDPCR技术,具体说就是一种利用PCR技术,对来源各异的mRNA样品里面的多种cDNA基因一并进行扩充增加与表达的实验方法。具体说就是:采用锚定反义和随机正义这两种类型不同的合成寡核苷酸引物,通过把具有不同来源的扩增cDNA产物的电泳带谱进行对比,能够发现表达存在差异的基因。在中药作用机理研究的过程中,唐发清等人主要探索了益气解毒片如何干预鼻咽癌患者细胞基因的表达,旨在立足于具有选择性特征的基因表达水平,研究益气解毒片对于鼻咽癌进行防治的机理,最终得出研究结论:益气解毒片能够在患者的机体外有效地抑制鼻咽癌细胞基因的表达,除此之外,也可以诱导某些特异基因的表达,最终控制鼻咽癌细胞的生长和发展。
3核酸分子杂交技术
核酸分子杂交技术在目前的分子生物学领域是最基本的,其主要的应用原理为:基于特定的条件,2条核酸单链(具有一定的同源性)通过碱基互补退火形成双链。杂交的对象主要是待测核酸序列与探针,其中核酸被提取分离后在体外与探针进行杂交的被称为印迹杂交,而在组织细胞内直接进行杂交被称为原位杂交。在研究中药作用机理的过程中常用的比较早的有印迹杂交、点杂交和原位杂交。例如:二仙汤主要用于妇女更年期综合征的治疗,属于抗衰老的知名方剂,廖柏松等人利用核酸分子杂交技术,研究18月大的雌性大鼠下丘脑内阿片肽的基因表达水平,得出的研究结论认为:二仙汤组β内啡肽前体阿黑皮素原和脑啡肽原的mRNA水平得到了显著的提高,与未衰老前的水平相当。因此,可以得出这样的结论:二仙汤本身所具有的抵抗衰老的功能,是借助于增强抗氧化酶基因表达水平来实现的。
4DNA阵列技术
该技术属于新近发展的,能够数千个基因表达谱同时进行分析,其原理与核酸分子杂交相同。其称谓在不同的文献里边是不一样的,例如称作DNA芯片、微阵列和基因芯片等,目前区分不明确,一般情况下是混用的。目前,在对于中药基因表达水平进行的研究中,零星地采用商用或自制微阵列。例如:周联等人利用小鼠基因(含有2048个基因)的表达谱芯片,来对黄连解毒汤进行检验测试,旨在研究探索其怎样影响小鼠脾细胞的基因表达。测试得出结论:复方要比有效成分所具有的作用大得多,但是对基因表达的具体影响进行分析还具有相当的难度;王广良等人采取自制的cDNA微阵列(含有24个细胞周期相关基因),研究了抵抗肝癌肿瘤的四种中药(乌药、青蒿、紫草和黄芪)分子的机制,认为它们都程度不同地使细胞的生长周期与检测的损伤点基因带来了改变,其具体表现为部分地上调和下调,对于分子生物学技术进行比较,充分地证明了利用四种中药治疗癌症有其天然的合理性。在中药作用于人体的机理研究中,应用DNA阵列技术可以同时对使用中药前后的数千个基因表达的具体情况进行比较,并分析它们之间存在的差异,而且其优点也是比较明显的,例如:用于研究的样品使用量不多、操作的自动化水平比较高、接受测试的对象具有较高的DNA密度等。但是微阵列技术目前同时也具有很多的问题,例如该技术的高通量与小型化能够敏锐地感觉到外界和内部的变化,因此有必要采用平均值配合标准化的办法进行操作,但是截至目前仍然没有得到业界普遍认可操作标准和规则来规范指导微阵列实验,对数据进行采集分析的方法与相关的操作系统也大不相同。除此之外,基因表达和调控研究处于落后状态,导致难以解释在研究中药机理中所得到的很多信息,制作费用的昂贵也限制了这一技术的发展。
作者：刘小丹 单位：黑龙江迪龙制药有限公司
