1细胞凋亡测定
细胞凋亡采用FITC-PI双染色方法检测。制备转染后的GSCs细胞悬液，每管加入10μLFITC溶液，避光孵育30min后，每管加入10μLPI溶液，C6流氏细胞仪每管抽取10000个细胞进行分析。实验重复6次。细胞迁移及侵袭能力采用Transwell小室方法检测。制备转染后的GSCs细胞悬液，以每孔100μL含51×10细胞数接种于Transwell小室的上室，下室加入500μL高糖DMEM培养基（含10%胎牛血清），48h后取出小室，PBS清洗上室内的细胞，室温晾干后4%多聚甲醛固定30min，PBS清洗3遍，至于吉姆萨染色液中染色30min，取出室温晾干后，置于显微镜直接观察拍照，随机选取5个视野计数染色细胞个数。细胞侵袭能力检测需在Transwell小室的上室内预先铺置基质胶，置37℃、5%CO细胞培养箱中26h后备用，余步骤与细胞迁移实验相同。实验重复6次。统计分析用SPSS18.0统计软件对数据进行处理。实验数据用表示，两组间采用t检验，多组间采用单因素方差分析和Bonferroni检验，<0.05认为有统计学差异。
2结果
2.1U87来源的GSCs的鉴定
如图1A所示，U87细胞置于干细胞培养基培养后形成细胞球，此细胞球同时表达Nestin（神经干细胞标志物）及CD133（肿瘤干细胞标志物），在图1B中，细胞球在含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中进行分化培养2周后，细胞表达胶质细胞活化的典型标志物GFAP，以及神经元的典型标志物tubulinIII。以上结果说明在干细胞培养基形成的细胞球细胞为典型的胶质瘤干细胞，具有神经系统肿瘤干细胞的特征，并且具有多向分化能力。
2.2在GSCs中，miR-144呈现低表达状态
如图2所示，Real-timePCR结果显示，与non-GSCs相比，在GSCs中miR-144的表达明显降低（<0.01），说明miR-144可能参与了脑胶质瘤的发生和发展。
2.3转染后，miR-144的表达
如图3所示，在pre-miR-144组中，miR-144的表达显著提高（<0.01），而在anti-miR-144组中，miR-144的表达显著降低（<0.01）。
2.4过表达miR-144降低GSCs的细胞活力
如图4所示，在pre-miR-144组中，GSCs的细胞活力显著降低（<0.01），而在anti-miR-144组中，GSCs的细胞活力显著提高（<0.01），但是在pre-NC组和anti-NC组中，GSCs的细胞活力与对照组比较无统计学差异。
2.5过表达miR-144促进GSCs凋亡
如图5所示，在pre-miR-144组中，GSCs的细胞凋亡率显著增加至15.6%（<0.01），而在anti-miR-144组中，GSCs的细胞凋亡率显著下降到3.6%（<0.01）。但是在对照组，pre-NC组和anti-NC组中细胞凋亡率分别为8.1%，7.9%和7.9%，三组间无统计学差异。
2.6过表达miR-144抑制GSCs的细胞迁移及侵袭
如图6所示，在pre-miR-144组中，细胞的迁移能力显著降低（<0.01），而在anti-miR-144组中，细胞的迁移能力显著提高（<0.01）。但是在pre-NC组和anti-NC组中，细胞迁移能力与对照组比较无统计学差异。此外，在细胞的侵袭能力检测中，我们得到了相似的结果。
2.7MiR-144靶基因的预测
如图7所示，我们经过查阅生物信息学预测软件Targetscan、Pictar和RNAhybrid等，发现有众多基因存在miR-144的结合位点，经查阅文献得知其中X染色体连锁锌指转录因子（ZFX）和酪氨酸激酶受体（TEK）与GSCs的发生展有着密切的关系。
3讨论
在人体内，miRNAs含量巨大且种类繁多，其典型作用为降解靶基因mRNA或抑制其翻译，从而参与调控人体内的各种生命活动。近年来关于miRNAs的研究逐步增多，其主要的研究方向主要在于探寻miRNAs在各种生命活动中的作用，但许多研究显示miRNA在不同的组织及细胞中表达水平有着显著差[10]异。尤其是在普通细胞和干细胞中，由于干细胞具有的特殊能力导致其细胞内的诸多生命活动都有[2]别于普通细胞，因此关于miRNA在干细胞生命活动的机制研究显得尤为重要，并为揭示干细胞的特性及其产生机制提供了直接可靠的证据。脑胶质瘤是公认的神经系统的恶性顽疾，也是被研究最多的神经系统肿瘤，更是在所有肿瘤中较早成功分离鉴定出含有干细胞的肿瘤之一，关于脑胶质瘤干细胞的研究主要集中在其干细胞特性的研究，有研究显示CD133和Nestin等因子是维持脑胶质瘤干细胞干性的[11,12]必须因子，因此这两种因子也被认为是鉴定脑胶质瘤干细胞的特征因子。研究显示miR-101及miR-152等可通过抑制其下游靶基因的表达从而抑制脑胶[13,14]质瘤干细胞的恶性生物学行为，这些研究为脑胶质瘤的治疗指引了方向。但是由于miRNA的种类繁多及数量庞大，需要不断的研究来补充完善各方面的数据，以便为脑胶质瘤干细胞的研究提供更可靠全面的证据。故本研究着重探究miR-144在脑胶质瘤干细胞中的作用。进一步明确miR-144在脑胶质瘤干细胞中产生作用的可能机制，为脑胶质瘤的治疗提供新的方向及有效途径。在本研究中，我们成功分离鉴定了U87来源的GSCs，Real-timePCR实验结果显示与non-GSCs相比，miR-144在GSCs中呈现低表达状态，提示miR-144在脑胶质瘤的发生和发展中起重要作用。进一步的实验表明GSCs在转染miR-144mimics48h后，细胞活力显著降低，细胞凋亡率显著增加，细胞迁移及侵袭能力也同样呈现抑制状态。但是，在转染miR-144inhibitors后，我们通过上述实验观察到了相反的现象。以上结果有利的佐证了我们对miR-144在GSCs中起到了抑癌因子作用的推测，也为miR-144在GSCs中的抑制作用提供了可靠的证据。由于miRNAs的主要作用方式为降解靶基因mRNA或抑制其翻译，从而参与调控个体发育、细胞凋亡、增殖及分化等生命活动，我们通过查阅生物信息学预测软件（Targetscan，Pictar，RNAhybrid），发现有许多基因含有miR-144的结合位点，意味着这些基因可被其降解，并同时产生某些生物学效应。在众多的靶基因中我们发现有几个基因参与调控了GSCs的恶性生物学行为，例如X染色体连锁锌指转录因子可以通过增加c-Myc的表达水平，增加DNA的复制及促进细胞的增殖，从而维持GSCs的干[15]细胞特性及促进其恶性行为，又如酪氨酸激酶受体可与血管生成素1形成联合网络信号，介导GSCs与血管内皮细胞间的物质交换，并使俩者产生紧密的贴合，形成了脑胶质瘤发生发展的源头，并[16]为GSCs转移与侵蚀提供丰富的血液供给。以上只是我们发现的2个在GSCs中起到关键作用的miR-144的靶基因，但是细胞内的复杂联系是难以估量的，由此我们推断miR-144至少通过降解以上2个靶基因的表达，从而对GSCs的恶性生物学行为起到了抑制作用，但是是否还有其他的靶基因也参与其中，或是形成网络调节有待进一步的研究证实，本研究结果为脑胶质瘤的治疗提供新靶点。
作者：许晶廷 程洋 姚一龙 刘云会 单位：鞍山市中心医院神经外科 鞍山市中心医院手术室 中国医科大学附属盛京医院神经外科
