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子宫颈癌细胞论文

1蛋白质印迹(WesternBlotting)

本实验所用之Anti-GAPDH及anti-Bcl-xL是来自abcam(England)。将经过治疗或未治疗的细胞离心后去除上清液,以100μL(RIPA+proteinaseinhibitor)回溶并打散细胞,再以液态氮降温、室温回温共四个循环打破细胞,取其上清液。100μLBradford(Bio-Rad)加入96-well孔盘,每个well加2μL样本上清液,室温作用5min后,以光谱分析仪(R607-1)测量蛋白质浓度,设定波长为595nm,每个样本在蛋白质定量之后,浓度皆为2μg/mL。将定量完成的蛋白质,依体积加入5xdye,其余体积补RIPA。将样本置于水浴95℃,放置10min。将样本依序加入wells中,并加入pro-teinladder10μL,上层胶约跑30min,电压为60V;下层胶约跑50min,电压为100V。将WesternMembrane放置胶上,并再盖上2片filterpaper;翻面打开胶并再盖上2片filterpaper,并再两侧加上海绵填充物,置放入transfer模具中,压紧transfer模具置入跑胶器中,加入transferbuffer(3.04g_Tris,14.28g_Glycine,200mL_100%Meth-anol,andaddedddH2Oto1L)。将电源供应器及跑胶器置于4℃冰室中,连接好并设定100V,时间为60min。将westernmembrane取出,置于保鲜盒中,并加入5%脱脂牛奶,进行blocking,放置摇摇板中,转速为60rpm,常温中反应1h(5%nofatmilk:20mLPBSTand1gnofatmilk)。配置1stantibody(1:1,000)于5%脱脂牛奶中。blocking完成后,将5%脱脂牛奶倒掉,加入5%脱脂牛奶清洗,共清洗3次,每次5min。加入1stantibody于westernmembrane上,放置4℃冰箱的摇摇板上,转速为60rpm,反应过夜。隔天回收1stantibody保存于4℃冰箱中,并加入PBST清洗,共清洗6次,前4次8min,后2次5min。(PBST:40gNaCl,1gKCl,7.2gNa2HPO4,1.2gKH2PO4,addedddH2Oto5L,andadded5mLTween20)。配置2ndantibody(比例一般先尝试使用1∶25000)于5%脱脂牛奶中。将westernmem-brane放置parafilm上,加入配置好的2ndantibody,放置摇摇板上,转速为60rpm,反应90min于常温中。加入PBST清洗,共清洗6次,前4次8min,后2次5min。将清洗好的westernmembrane放置干净的暗盒上,加入HRPsubstrate(PeroxideSolu-tion+LuminolReagent)(Millipore),于常温中反应10min后,至暗室加入底片并完成成相。

2结果

2.1艾叶萃取物对子宫颈癌细胞的影响

如图1所示,与对照组(DMSO、Medium)相比,加入越高浓度艾叶萃取物的组别,其HeLacells的细胞数量越少。显示艾叶萃取物能够对He-Lacells的生长产生影响,并且与艾叶萃取物的浓度呈现正相关。

2.2艾叶萃取物造成子宫颈癌细胞早期凋亡

为了确认子宫颈癌细胞早期凋亡的情况,以流式细胞技术(FlowCytometry)测量AnnexinVposi-tive的比例。结果显示(图2)对照组(DMSO、Medium)AnnexinVpositive的比例为3.15%与2.96%。在实验组方面,随着提高艾叶萃取物的浓度,AnnexinVpositive的比例逐渐增加,分别为2.92%、3.97%、8.76%、7.08%、13.1%、19.8%,实验组AnnexinVpositive的比例皆超过对照组。显示艾叶萃取物确实能够造成子宫颈癌细胞早期凋亡。

2.3艾叶萃取物對子宫颈癌细胞表現Bcl-xl的影响

以WesternBlotting确认各组Bcl-xl的表达量(图3),发现越高浓度的艾叶萃取物有越低的Bcl-xl表达量。此结果可以说明艾叶萃取物透过mito-chondriapathway引发子宫颈癌细胞凋亡。

3讨论

在早期细胞凋亡时,部分粒线体内膜层(Phosphatidylserine)会外翻至外膜层,因此,藉由AnnexinV与粒线体外翻内膜层(Phosphatidyl-serine)的结合,可以侦测到细胞早期凋亡的情形。回顾本研究结果,以流式细胞技术(FlowCytome-try)侦测AnnexinV与PI,侦测粒线体内膜。发现艾叶萃取物浓度越高,AnnexinV阳性比例亦越高,显示艾叶萃取物能够造成粒线体内膜外翻等细胞凋亡的早期现象。细胞凋亡的机制至少包含两种:Mitochondriapathway与FASpathway。其中,Mitochondriapath-way藉由活化Bak、Bad、Bid及Bax,促使粒线体内膜外翻并释放出cytochromeC,进一步造成细胞凋亡。其中,Bcl-2与Bcl-xl会藉由抑制cytochromeC的释出以阻止apoptosis的发生[9,10]。一般将Bcl-2family分成两类:Bak、Bad、Bid属于亲凋亡类(Pro-apoptoticClass);Bcl-2、Bcl-xl为抗凋亡类(Anti-apoptoticClass)。另外,引起细胞凋亡的蛋白质包含Bax和Bim等[11]。本实验以WesternBlotting确认各组Bcl-xl的表达量,发现艾叶萃取物浓度越高,抑制cytochromeC释出的Bcl-xl表达量则越低,表示艾叶萃取物确实经由Mitochondriapathway引发HeLacells的凋亡。综合上述,艾叶萃取物确实能够引发HeLacells的凋亡,并且藉由Bcl-xl的表达量被抑制的结果,可以说明引发HeLacells凋亡的机制应该是mitochondriapathway,但需要更进一步的实验结果才能充分证实。

管理期刊者:陈怡斌 邱健泰 李宗谚 单位:台湾长庚大学 台湾长庚纪念医院中医部 台湾长庚大学生物医学系 台湾林口长庚纪念医院


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