摘要：作为一种比较先进的基因修饰技术，锌指核酸酶技术已经在多种生物转基因研究领域得到了应用，包括植物、昆虫、各类动物乃至人类细胞中，强化了人们对于动物复杂生理系统的理解和认知，不仅使得锌指核酸酶技术成为构造转基因生物的强力工具，更使得其在许多疾病的治疗中发挥出了重要作用。本文主要对锌指核酸酶在动物转基因研究中的应用及进展进行了讨论。
关键词：动物转基因；锌指核酸酶；应用；进展
前言
转基因在当前的科学研究领域虽然并非新的课题，但是其受瞩目的程度有增无减，主要是从特定生物体的基因组内提取所需的目的基因，或者人工合成指定序列的DNA片段，将其转入到生物体中，与生物体的基因组重组后，结合人工选育，获得具有稳定表现特定的遗传性状的个体，在新品种的培育方面意义重大。不过，常规意义上的转基因一般是指植物，如水稻、玉米等，对于动物转基因的研究尚属于一个比较新颖的领域。
1锌指核酸酶概述
锌指核酸酶（ZincFingerNuclease）属于一种人工合成酶，其化学本质为蛋白质。锌指核酸酶是一个由DNA识别结构域以及非特异性核酸内切酶的剪切结构域融合而成的物质，其N末端为锌指蛋白DNA结构域，包括了一系列的锌指蛋白，每一个锌指蛋白都能够对一个特意的三联体碱基进行识别和结合；C末端为非特异性核酸酶剪切结构域。相比较同源重组的DNA序列，锌指核酸酶具有更强的稳定性，而且其内部锌指结构和DNA强亲和性的特点，使得锌指核酸酶有着非常突出的特异性作用。锌指核酸酶技术凭借自身能够特异性识别并切割DNA序列的特点，以及良好的可设计性，被用于基因的定点突变和外源基因的定点整合，是最近几年发展起来的一种基因修饰技术。锌指核酸酶技术能够将一个非特异性的核算内切酶与含有锌指的结构域结合在一起，实现对于特定序列的切割。理论上，可以利用这种技术对染色体特定片段的删除，完成突变体的构造或者疾病的治疗[1]。在不断的研究过程中，锌指核酸酶已经被成功应用于动植物的转基因研究中，就实际效果而言，具有极高的基因整合效率。而在相关研究实验中，对特异性的锌指蛋白（ZFP）进行设计，是最为核心的内容。在针对ZFP识别结构域进行设计时，存在两种不同的思路，一是寡聚体库工程法，其所构建的锌指核酸酶与靶DNA具有较高的亲和性及特异性；二是模块组装法，即将能够识别三个连续碱基的锌指看作模块，参照目标序列，将不同的模块拼接在一起。
2锌指核酸酶在动物转基因研究中的应用及进展
经过了大量的研究和试验，锌指核酸酶技术在动物转基因的研究中得到了成功应用，取得了相当显著的进展，其主要体现在以下两个方面：
2.1基因定点敲除
在传统转基因研究中，采用的基因打靶技术虽然比较可靠，但是效率非常低下，在很大程度上阻碍了研究的进展，而锌指核酸酶技术（下文统称ZFN）的出现，为动物转基因的研究提供了一种相当可靠的技术手段。早在2001年，Bibikova等人就利用ZFN的特异识别性能，构建了一个靶基因质粒载体，这种载体与表达ZFN的质粒共同注入到卵母细胞中，发现ZFN能够切开靶基因，并利用同源重组对切口进行修复。在这个研究的基础上，他们又利用ZFN技术，敲除了X染色体上存在的yellow基因，同时发现这种变异可以非常稳定的遗传给后代。上述研究结果使得ZFN技术在动物转基因的研究中的应用成为了可能。Meng等人在相关研究中，针对斑马鱼血管内皮细胞的生长因子受体基因，设计出了一种ZFNmRAN，将其注入到细胞期的斑马鱼胚胎中，能够带来极大的突变效率，虽然同样存在有脱靶现象，但是相关的研究实验也从正面表明了可以通过注入mRNA的方式，实现基因打靶[2]。利用专业打靶GGTA1基因，对半乳糖苷酶转移酶的催化区域中的ZFN进行编码，可以得到相应的突变个体，产生GGTA1基因敲除的母体，而通过将ZFN电转染入雄体胚胎成纤维细胞的方式，同样能够实现基因打靶，打靶效率在5.7%，产生GGTA1基因敲除的雄体，表明ZFN在雌雄细胞中都能够起到相应的基因敲除作用，从而为人类基因相关疾病的治疗提供了一个良好的模型。
2.2基因定点重组
上述研究均表明，ZFN技术的应用，能够非常显著的提升基因靶向敲除的效率，而事实上，其在动物转基因中取得的进展不止于此。最近的一些研究项目表明，ZFN技术在提高同源重组效率，实现基因定点重组方面同样有着巨大的作用。Porteus等人将预先构建好的ZFN特异识别序列插入到GFP基因中，然后将其整合到了HEK293细胞中，形成了具备突变型GFP的HEK293稳定细胞系，并利用连接在CMV启动子上的ZFN表达质粒以及表达野生型GFP同源供体质粒，对稳定细胞系进行转染。结果显示，部分细胞中存在的突变GFP得到了修复，这也表明了ZFN技术可以在哺乳动物体细胞中实现基因打靶。另外，2010年，Melanie等针对小鼠Rosa26基因，设计构筑了一对ZFN，将潮霉素基因同源打靶载体、Venus同源打靶载体以及β-半乳糖苷酶分别与ZFN一起注射到了小鼠原核胚胎中，产生了转基因小鼠，经分析鉴定，同源打靶效率在1.7%-4.5%左右[3]。
3结语
总而言之，大量的研究实验表明，锌指核酸酶技术在动物转基因研究中得到了成功应用，取得了相当的成果，能够在细胞水平或个体水平上，进行相应的基因敲除和基因重组操作，从而为没有获得ES细胞的转基因动物提供了一种基因操作的可能性。虽然从目前来看，锌指核酸酶技术在实际应用层面尚存在一些不足，但是相信经过不断的研究和探索，相关技术必然会愈发完善。
参考文献：
[1]刘晓,方永志,刘文浩,等.锌指核酸酶技术在动物转基因研究中的应用[J].山东农业科学,2013,45(2):135-138.
[2]王刘豪,王吉田,余昊,王运兵.锌指核酸酶技术在动物转基因中的应用[J].湖北农质量管理论文业科学,2012,51(9):4177-4180.
[3]袁玉国,彭秋玲.锌指核酸酶技术在动物转基因中的研究进展[J].中国畜牧兽医,2014,41(8):188-192.
