【摘要】目的:探讨KLF8(Kruppel－likefactor8)在缺氧诱导胃癌细胞多药耐药表型中的作用。方法:利用Westernblot和实时定量PCR的方法检测三株胃癌细胞系MKN28、MKN45、SGC7901在常氧及缺氧条件下KLF8的表达水平。Westernblot和实时定量PCR检测胃癌耐药细胞系SGC7901/VCR、SGC7901/ADR和亲本细胞系SGC7901中KLF8的表达水平。构建KLF8正义表达载体及KLF8小干扰RNA的慢病毒载体，将其转染入实验细胞中，用Westernblot和实时定量PCR的方法检测KLF8表达量的变化。MTT、AnnexinV/PI染色法及阿霉素蓄积量与潴留实验检测KLF8在缺氧诱导胃癌细胞多药耐药表型中的作用。结果:缺氧可诱导胃癌细胞系MKN28、MKN45、SGC7901中KLF8的表达升高。与胃癌亲本细胞系相比，KLF8在胃癌耐药细胞系中的表达升高，并且在SGC7901/VCR细胞中表达升高的更为明显。外源性转染KLF8后可显著增加胃癌细胞中KLF8的表达量，KLF8小干扰RNA可有效降低常氧及缺氧条件下胃癌细胞中KLF8的表达。常氧条件下，外源性转染KLF8的正义表达载体可增加胃癌细胞对不同化疗药物的耐受性，降低化疗药物诱导的胃癌细胞凋亡指数，同时可增加细胞内阿霉素的泵出率。缺氧条件下，KLF8小干扰RNA能够逆转胃癌细胞中上述现象的发生。结论:初步实验结果发现了一个新的缺氧反应分子－KLF8。表型试验证实该分子在缺氧诱导胃癌多药耐药中发挥作用。
【关键词】Kruppel－likefactor8;多药耐药;胃癌;缺氧
缺氧是肿瘤组织中重要的微环境，在实体瘤中普遍存在，随着瘤体的不断增长及肿瘤组织中血管的畸形生长，必然会导致肿瘤组织中氧分压下降，形成区别于正常组织的缺氧环境［1－3］。我们前期研究结果发现缺氧能够加剧胃癌细胞的多药耐药的发生，但机制尚不清楚［4－6］。本实验室的胃癌细胞系分别经常氧和缺氧培养发现，缺氧后胃癌细胞中KLF8的表达量明显升高，同时也发现KLF8在胃癌耐药细胞系中呈高表达状态，提示KLF8可能参与了缺氧条件下胃癌细胞多药耐药现象的发生。为此本实验以胃癌细胞为研究对象，探讨缺氧条件下KLF8参与胃癌细胞多药耐药的机制，旨在更加全面了解缺氧诱导胃癌细胞发生多药耐药的机制。
1材料和方法
1．1材料
人胃癌细胞系SGC7901引自军事医学科学院，人胃癌细胞系MKN45和MKN28引自中科院上海细胞库由本实验室保存;人胃癌长春新碱耐药细胞系SGC7901/VCR由西京医院消化内科实验室惠赠。用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液常规培养人胃癌细胞SGC7901、MKN28、MKN45及耐药细胞SGC7901/VCR。待细胞密度达70%后，将细胞分别置于常规培养孵箱(37℃，5%CO2)及缺氧孵箱(37℃，5%CO2，1%O2，94%N2)中继续培养。其中SGC7901/VCR培养液中需加入1μg/ml的长春新碱(VCR)作为其维持浓度。
1．2方法
1．2．1RNA
提取和实时定量聚合酶链反应(RT－PCR)利用TRIzol试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)提取培养细胞或组织中的总RNA。用PrimeScriptRT试剂盒(TaKaRa，Dalian，China)合成cDNA。用SYBRPremixExTaqII(TaKa-Ra)进行聚合酶链反应并用Bio－RadCFX96TMManager(Bio－Rad，Hercules，USA)进行检测。基因引物购自TaKaRa(Dalian，China)。KLF8的RT－PCR引物为(正义链):5＇－TCTGCAGGGACTACAGCAAG－3＇以及(反义链):5＇－TCA-CATTGGTGAATCCGTCT－3＇。GAPDH引物为(正义链):5＇－TGACTTCAACAGCGACACCCA－3＇以及(反义链):5＇－CAC-CCTGTTGCTGTAGCCAAA－3＇。PCR的条件为:95℃5秒，55℃30秒和72℃30秒，45个循环。GAPDH被用做内对照。所有的RT－PCR反应均重复三次。用2－ΔΔCt进行基因定量水平的检测。KLF8表达的结果用lg(2－ΔΔCt)表示。
1．2．2蛋白提取和Westernblot
待各种胃癌细胞密度生长达90%后，分别用1ml冰的PBS清洗细胞两次，随后再加入1mlPBS，用细胞刮将细胞刮下，移液器将细胞悬液移入1．5ml离心管中，1000×g，4℃离心5min;用吸引器小心地吸出上清，加入100μl细胞裂解液，用超声探头进行超声使其充分裂解，每种细胞超声3次，每次7～10s，间隔1～2min;超声后，冰上静置15～20min，随后放置4℃离心机中，12000r/min，离心15min;吸取上清为各胃癌细胞总蛋白质，蛋白定量，加入5×LoadingBuffer后－20℃冻存备用。配制SDS－PAGE凝胶，取适量的蛋白样品给每孔道进行上样;电泳:恒流20mA，60min;裁剪合适大小的NC膜及滤纸，将裁好的NC膜浸泡在转膜缓冲液中10min，备用;转膜:由下至上放置的顺序为:滤纸、NC膜、凝胶、滤纸。恒压条件下转膜，20V，30min;用TBST配制含5%牛奶的封闭液，室温封闭1h;用含2%牛奶的TBST稀释一抗，4℃封闭过夜;选择合适的二抗，用TBST稀释后，室温下封闭1h;用ECL显色液进行显影。
1．2．3构建正义表达载体和小干扰
RNA慢病毒制备和转染KLF－8siRNA干扰序列的设计和合成以及载体构建由上海吉凯公司完成。序列如下:KLF8－siRNA1:5＇－ACUUG-GAGGUCCAACUUAATT－3＇，5＇－UUAAGUUACCUCCAAGGTG－3＇;KLF8－siRNA2:5＇－CGAUAUGGAUAACUCAUATT－3＇，5＇－UAUGAGUUUAUCCAUAUCGAC－3＇;KLF8－siRNA3:5＇－CACUGGUUAAUGACAUCAATT－3＇，5＇－UUGAUGUCAU-UAAACAGUGCTA－3＇;scrambledsiRNA(阴性对照)5＇－UU-CUCCGAACGUGUCACGUTT－3＇，5＇－ACGUGACACGUUCG-GAGAATT－3＇。检测敲除的效力后，合成了编码发夹的寡核苷酸，克隆至慢病毒载体PsicoR(Addgene)。非靶发夹DNAPsicoR载体作为阴性对照。在第7天用KLF8siRNA－慢病毒或阴性对照病毒转染SHC7901细胞，至第10天检测转染效力。将KLF8的过表达，小干扰RNA及空载体病毒转染入SGC7901细胞中，转染后细胞分别为SGC7901－KLF8、SGC7901－siKLF8、SGC7901－NC;将KLF8的小干扰RNA及空载体病毒转染入SGC7901/VCR细胞中，转染后细胞分别为SGC7901/VCR－siKLF8、SGC7901/VCR－NC。
1．2．4体外药物敏感性试验
用胰酶常规消化胃癌细胞，800r/min离心5min，收集细胞沉淀;用正常培养液重悬，制成单细胞悬液，细胞计数;用移液器吸取200μl稀释后的单细胞悬液，加入96孔板的每孔中，并使每孔的细胞数达5×103个，放入孵箱常规培养;待细胞贴壁后，将细胞分别放入常氧及缺氧孵箱继续培养24h;将四种化疗药物按不同浓度，一定顺序加入每孔细胞中，随后继续常氧及缺氧培养48h，每孔细胞培养液中加入20μlMTT溶液，37℃孵育4h，用一次性针头小心吸弃孔内上清;每孔加入150μlDMSO，震荡器上震荡10min，使结晶充分溶解;在酶联免疫仪上选择490nm波长测定吸光度值，计算5孔的平均值(X值)。根据存活率的公式，计算不同化疗药物不同浓度时胃癌细胞的存活率;细胞存活率=(实验组X值－空白对照组X值)/(阴性对照组X值－空白对照组X值)×100%;细胞死亡率=1－细胞存活率;IC50:将不同化疗药物的浓度及对应的细胞死亡率分别输入IC50统计软件中，计算得出胃癌细胞对不同化疗药物的IC50值。
1．2．5流式细胞仪检测细胞凋亡
转染48小时后收集各组细胞，PBS缓冲液洗涤，胰酶消化，调整细胞密度至1×106/ml，取100μl细胞悬液于5ml流式管，加入5μlAnnexinV－FITC和10μl碘化丙啶(PI)溶液，轻轻混匀，室温避光染色15分钟。在反应管中加入400μlPBS，立即行流式细胞仪检测，以对照细胞为对照组。每个样本重复3次。
1．2．6细胞内阿霉素蓄积和潴留的检测
待胃癌细胞达对数生长期后用胰酶消化细胞并移入离心管中，800r/min离心5min，收集细胞沉淀;随后将细胞接种于6孔板中，使每孔细胞密度达70%，将细胞分别放置常氧及缺氧孵箱中继续常氧或缺氧培养24h，取出细胞，阴性对照孔常规细胞换液，ADR蓄积孔及潴留孔中分别加入ADR，使终浓度达到5mg/L，继续常氧或缺氧培养1．5h，流式细胞仪检测，激发波长为488nm，接受波长575nm，细胞中可出现红色标记物即为ADR，可计算出细胞中ADR的蓄积量及潴留量，根据公式可得出药物的泵出率，药物泵出率=(细胞中阿霉素蓄积量－细胞中阿霉素潴留量)/细胞中阿霉素蓄积量×100%。
1．3统计学方法
采用SPSS18．0软件包进行统计分析，计量资料数据用均数±标准差表示，计量资料的比较采用Kruskal－WallisH检验，两组间差异比较用Mann－WhitneyU检验;计数资料比较采用卡方检验，Westernblot灰度值、生长曲线、细胞凋亡采用t检验。P＜0．05时对比组之间的差异具有统计学意义。两组间相关性采用Spearman相关分析。
2结果
2．1缺氧条件下KLF8的mRNA水平和蛋白表达
将MKN45细胞、MKN28细胞及SGC7901细胞分别经常氧及缺氧处理后，利用定量PCR和Westernbolt方法检测胃癌细胞中的mRNA水平和蛋白表达的变化，结果显示，与常氧条件下相比，三株胃癌细胞系在缺氧培养后KLF8的mR-NA表达水平和蛋白表达均有所上升，MKN45和SGC7901细胞经缺氧处理后KLF8的mRNA水平和蛋白表达呈时间依赖性升高。MKN28细胞在缺氧4小时后KLF8的mRNA水平和蛋白表达显著升高(图1)。以上结果显示，缺氧显著增加了不同胃癌细胞系中KLF8的mRNA表达水平。
2．2胃癌耐药细胞系中KLF8的表达水平
分别提取SGC7901细胞、SGC7901/VCR细胞及SGC7901/ADR细胞三种细胞的RNA和蛋白，利用PCR和Westernblot方法检测KLF8在三种细胞中的mRNA水平和蛋白表达。结果显示，和SGC7901细胞相比，KLF8的mRNA水平和蛋白表达在SGC7901/VCR细胞及SGC7901/ADR细胞中均显著增高，且在SGC7901/VCR细胞中表达升高的更为明显(P＜0．01)。
2．3构建KLF8过表达和siRNA载体及其在转染细胞中的表达
实时定量PCR方法和Westernblot检测各转染细胞中KLF8的表达量。结果显示:稳定转染KLF8的正义表达载体后，SGC7901细胞中KLF8的表达量明显升高，稳定转染KLF8－siRNA载体后，耐药细胞SGC7901/VCR细胞及缺氧条件下SGC7901－siKLF8细胞中的KLF8表达量均显著降低。以上结果说明，构建的载体均可有效地促进或抑制KLF8的表达，稳定转染的细胞系均可用于后续实验。
2．4KLF8参与缺氧诱导胃癌细胞多药耐药的表型研究
2．4．1KLF8影响胃癌细胞对化疗药物的敏感性
体外药敏实验(MTT法)结果显示，常氧条件下，与SGC7901细胞及SGC7901－NC细胞相比，SGC7901－KLF8细胞对四种化疗药物的敏感性均降低;随后观察了耐药细胞对化疗药物敏感性，发现SGC7901/VCR－siKLF8细胞对化疗药物的敏感性均较SGC7901/VCR细胞和SGC7901/VCR－NC细胞对化疗药物的敏感性有显著增加(表1)。缺氧条件下，SGC7901－siKLF8细胞和SGC7901/VCR－siKLF8细胞对四种化疗药物的敏感性均有所增加(表2)。以上结果提示，KLF8过表达可增加胃癌细胞对化疗药物的耐受性，促进了多药耐药现象的发生，干扰KLF8表达后可有效抑制缺氧诱导的多药耐药现象的发生。
2．4．2KLF8影响胃癌细胞的凋亡
通过流式细胞仪检测常氧组细胞及缺氧组细胞在VCR诱导下的细胞凋亡指数。结果显示，常氧条件下，用VCR诱导常氧组细胞后，发现与SGC7901细胞、SGC7901－NC细胞相比，SGC7901－KLF8可明显抵抗VCR诱导的细胞凋亡，其凋亡指数显著下降，具有统计学意义(P＜0．05);而未经VCR诱导的常氧组细胞，其细胞很少发生凋亡，凋亡指数均较低且无统计学差异(P＞0．05)(图4左)。缺氧条件下，抑制KLF8表达后，SGC7901－siKLF8细胞对VCR诱导的细胞凋亡指数较SGC7901细胞及SGC7901－NC细胞的凋亡指数明显升高，具有统计学意义(P＜0．05);未经VCR诱导的缺氧组细胞，其凋亡指数无差异(P＞0．05)。以上结果提示，KLF8过表达可增强胃癌细胞的抗凋亡能力从而介导胃癌细胞多药耐药的表型，抑制KLF8的表达可逆转缺氧诱导的胃癌细胞多药耐药的表型。
2．4．3KLF8影响胃癌细胞中阿霉素的泵出率
用流式细胞仪检测ADR在常氧组及缺氧组细胞中的潴留量与蓄积量，根据公式计算药物泵出率。结果显示，常氧条件下，与SGC7901细胞和SGC7901－NC细胞相比，SGC7901－KLF8细胞中化疗药物阿霉素的泵出率显著增加，且具有统计学意义(P＜0．05);缺氧条件下，抑制KLF8的表达后，SGC7901－siKLF8细胞中化疗药物阿霉素的泵出率明显减少。以上结果提示，KLF8可通过提高胃癌细胞对化疗药物的泵出率从而介导胃癌细胞多药耐药现象的发生，抑制KLF8表达后此现象可被逆转。
3讨论
胃癌是我国最常见的消化道肿瘤，在我国超过半数以上的胃癌病例在发现时已处于晚期，肿瘤的转移和复发是导致患者死亡的最主要原因［7－8］。众多研究发现，在实体瘤中，缺氧这一重要现象普遍存在，随着瘤体的不断增长，其肿瘤中心的缺氧程度也逐渐加重。缺氧已被证实为肿瘤中重要的微环境，它可导致肿瘤细胞产生多药耐药的现象，成为肿瘤复发和疗效差的主要原因［4，9－10］。我们以往的研究发现缺氧能够诱导胃癌多药耐药的发生［6，11－12］。但是缺氧诱导胃癌多药耐药的机制仍待进一步研究;本研究发现缺氧能够诱导转录因子KLF8的表达，进一步的研究发现在胃癌耐药细胞中KLF8的mRNA及蛋白水平均显著上调，提示KLF8参与了缺氧条件下胃癌细胞多药耐药的发生。KLF8是SP1/KLF家族的成员之一，KLF8在多种肿瘤细胞中广泛分布，如乳腺癌、卵巢癌、肝癌等。因其KLF家族中蛋白的特异性结构，所以KLF8可以与下游靶基因启动序列上的CACCC盒或GT盒结合发挥促进或抑制作用。KLF8在肿瘤细胞中的高表达状态可以导致肿瘤细胞发生恶性变，患者预后较差。KLF8可以使肿瘤细胞发生EMT，增加了肿瘤细胞的侵袭和转移能力［13］;可以促进细胞增殖，使肿瘤细胞生长不断增加;可以增加肿瘤细胞的抗凋亡能力，导致治疗失败［14］;促进MMP9的表达，使肿瘤发生侵袭和转移;它还可以抑制E钙粘素的表达，促进EMT的发生。我们既往的研究发现缺氧通过上调KLF8诱导EMT的发生从而促进胃癌细胞的转移［15］。然而，关于KLF8与胃癌的肿瘤多药耐药的相关性尚无报道。我们的研究提示KLF8与耐药密切相关，可能对耐药起着重要的调控作用。进一步的研究发现外源性增加KLF8的表达可同时降低胃癌细胞及胃癌耐药细胞对化疗药物的敏感性，抵抗化疗药物诱导的细胞凋亡，增加化疗药物的泵出率;外源性干扰KLF8的表达，可逆转缺氧诱导的胃癌细胞多药耐药的表型。以上结果提示我们，KLF8参与了缺氧条件下胃癌细胞多药耐药表型的发生。目前对肿瘤细胞发生多药耐药机制的研究主要集中在以下几个方面:①耐药相关蛋白，此类蛋白主要有P糖蛋白(P－glycoprotein，P－gp)、肺耐药相关蛋白(lungresistanceprotein，LRP)、乳腺耐药相关蛋白(breastcancerresistanceprotein，BCRP)等，此类蛋白通过促进化疗药物的外排，抑制化疗药物进入细胞核，使化疗药物在细胞中局域化等途径参与了肿瘤耐药的形成［16－18］;②凋亡相关途径，通过抗凋亡蛋白Bcl－2/Bax的比率明显增加，抑制细胞凋亡，介导了耐药的发生［19］。而近年来，越来越多的学者发现肿瘤的多药耐药不仅仅是肿瘤细胞内部结构变化的结果，也是肿瘤细胞与外部环境相互作用的结果。本课题的研究者在以往的研究中发现了缺氧条件是促进胃癌细胞发生多药耐药的重要的肿瘤微环境，并首次报道了缺氧诱导因子HIF－1在缺氧诱导胃癌多药耐药中发挥重要作用［11］。通过我们的实验发现，缺氧通过上调KLF8参与了胃癌多药耐药发生，KLF8在缺氧与胃癌细胞相互作用下促进胃癌多药耐药发生过程中发挥了关键作用。进一步的研究发现KLF8通过增加化疗药物的泵出和抵抗凋亡而参与了胃癌细胞缺氧条件下多药耐药的发生。我们通过生物信息学分析发现在KLF8的启动子区域存在HIF－1的结合位点，因此HIF－1是否能够上调KLF8的表达;同时，KLF8作为转录调控因子，是否是通过上调P－gp家族和抗凋亡分子参与缺氧条件下胃癌多药耐药的机制将在未来的研究工作中进一步展开。
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作者：杨雪 王亚芳 张慧 刘理礼 单位：第四军医大学附属唐都医院肿瘤科
