1构建胶原结合域（CBD）生长因子变异体
胶原具有抗原性小、生物降解性和相容性良好等优点，在组织修复中得到广泛的应用[16]。为了提高胶原支架在组织修复中的作用，往往将外源性生长因子结合至胶原支架中[17]。但是，生长因子吸附至胶原支架中的方法无法满足组织修复的需要，因为生长因子快速扩散可导致活性降低或丧失[18]。所以，增加生长因子与支架的吸附能力，从而保持足够的浓度显得尤为重要。研究发现，7个氨基酸系列多肽（即胶原结合域）通过结合天然生长因子的N末端，能增加生长因子与胶原支架的黏附能力，从而防止生长因子的快速扩散，并维持合适的浓度。以往的研究表明，表皮生长因子、转化生长因子和碱性成纤维细胞生长因子通过来源于vWF的胶原肽修饰后，其组织修复效果优于天然的生长因子。但是这些研究仅强调了支架中生长因子的可控释放，缺乏组织再生的相关研究[19-23]。Lin等[24]将来源于胶原酶的CBD（TKKTLRT）与血小板源性生长因子（PDGF-BB）的N末端结合，组成一种胶原靶向系统，能特异性地结合至胶原支架中，并能保持生长因子的活性；在体内，与天然的PDGF支架相比，CBD-PDGF支架具有更佳的促细胞化和血管再生的能力。来源于vWF或胶原酶的CBD主要用于研究药物的可控释放，但经CBD修饰的生长因子在支架中的发挥效果还不明了。Zhao等[25]将两种来源不同的CBD引入至bFGF中。一种来源于vWF的CBD与bFGF结合（V-bFGF），另一种是来源于胶原酶的CBD与bFGF结合（C-bFGF），研究不同来源的CBD-bFGF在组织修复中的作用。结果显示，两种组合体都保留了生长因子的活性和结合胶原基质的特性。两种组合体在结合胶原基质、促血管化和细胞化的作用方面均优于天然的bFGF，但C-bFGF的作用优于V-bFGF。表明CBD结合bFGF是一种能促进伤口愈合和组织再生的靶向治疗系统；C-bFGF赋予bFGF更高的胶原亲和力，促进细胞化和血管化的作用优于v-bFGF。研究认为，CBD-生长因子/胶原系统在膀胱再生中可能具有促进组织再生的作用。Chen等[26]应用CBD-bFGF/胶原支架修复部分切除后的小鼠膀胱，并观察修复术后膀胱组织和功能的修复情况。结果显示，术后90d，在支架与周围膀胱组织的结合、支架的降解和细胞化、平滑肌再生和血管化、膀胱的顺应性等方面，CBD-FGF/胶原支架组优于FGF/胶原支架和PBS/胶原支架组。表明CBD-FGF/胶原支架能更好地促进膀胱的再生。膀胱的再生涉及多种生长因子，单一的生长因子不足以满足膀胱再生的需要[27]。所以促进膀胱再生的最佳生长因子、最佳剂量和最佳的生长因子载体系统需要更进一步的研究。
2生长因子的基因治疗
由于外源性生长因子具有对热和化学处理敏感、半衰期短、难以控制其在支架中的分布等不足[28]。将外源性的生长因子基因导入目的细胞并有效表达，已引起广泛关注。基因治疗需要合适的载体，目前研究较多的是逆转录病毒载体或腺病毒载体[28-29]。通过载体介导能表达生长因子蛋白的基因，并转染至种子细胞或支架中，使基因在局部持续、稳定、缓慢、高效表达生长因子蛋白，并且有利于生长因子浓度的精确维持，更好地调控组织的修复和再生。为了研究VEGF基因修饰后对血管再生的作用，Lwaguro等[30]应用VEGF基因修饰的血管内皮祖细胞（EPC）改善肢体缺血动物模型中的血管生成。结果显示，VEGF基因修饰过的EPC能明显改善缺血组织的血液供应，且达到同样效果所需要的转基因EPC数量较未转基因的少30倍，提示联合VEGF基因的EPC治疗是一种更高效的促进血管再生的治疗模式。Chen等[31]将复合VEGF基因修饰EPC的膀胱脱细胞基质（BAMG）用于膀胱组织的构建，采用含VEGF基因的腺病毒载体转染自体外周血EPC，种植于同种异体猪BAMG，体外培养3d后回植，结果显示BAMG对EPC无细胞毒性；组织工程膀胱的功能和组织学检查表明膀胱组织随时间延长逐渐再生；与对照组相比，VEGF基因-EPC/BAMG组的血管密度增加明显。Guan等[29]借鉴VEGF在缺血性心肌病治疗中所取得的经验，应用VEGF165基因插入逆转录病毒载体pMSCV-GFP中，构建pMSCV-VEGF165-GFP载体，逆转录病毒载体转染膀胱尿路上皮细胞（UC）后种植于同种异体兔动脉脱细胞基质中，研究基因治疗在组织工程尿道中的应用。结果提示，基因修饰过的UC能同时表达VEGF和GFP蛋白，且细胞分泌VEGF呈时间依赖性；与仅以GFP修饰的细胞相比，VEGF修饰的UC增加血管形成更明显，同时形成的尿道上皮层更光滑、排列更规则，与正常尿道相似。病毒载体具有潜在的致癌毒性和免疫原性，所以相关研究开始聚焦于非病毒载体。研究发现，非病毒转基因载体能够浓缩质粒，被细胞内吞并进入细胞核，从而使质粒表达基因产物[32]。林茂虎等[33-34]将VEGFl65cDNA克隆于真核表达载体pcDNA3.1(-)，构建真核表达质粒载体pcDNA3.1(-)／VEG-Fl65，并转染入分离纯化的鼠膀胱平滑肌细胞内。结果显示，pcDNA3.1(-)/VEGF165转染入鼠膀胱平滑肌细胞后，VEGF的表达增高，转染后细胞上清液具有促使内皮细胞增殖的生物学活性。将平滑肌细胞植入小鼠体内，并以膀胱缺损自然愈合和单纯植入小肠黏膜下组织（SIS）为对照进行观察，发现术后2周转染VEGF组中新生毛细血管数量和VEGF受体的阳性表达细胞数高于单纯SIS植入组。
3纳米或微米载体技术
随着纳米和微米技术在医学应用中的发展，纳米和微米载体为外源性生长因子的可控释放和活性保护提供了新的思路。该技术作为药物的一种新型缓释系统，常采用微球或微囊的形式，具有明显的优势：①可以实现生长因子的长期释放，可控性强[35-36]；②可以实现多种生长因子的同时或顺序释放[37-38]；③可使外源性生长因子具有长期生物活性[39]。同时，纳米和微米载体无免疫源性和毒性，具备较高的转移效率。所以，纳米和微米载体技术在骨骼、软骨、皮肤、心瓣膜、血管和神经等组织的修复重建研究中应用广泛。Geng等[39]为了实现VEGF的长期持续释放，制备了一种新型的VEGF-纳米微球-热敏感性水凝胶系统，并将该系统植入BAMG内。通过体内、体外研究，研究者发现纳米微球包裹的VEGF的生物活性得以保持，持续释放时间超过60d，未出现急性组织反应、炎症和毒性反应。该新型生长因子释放系统可能为泌尿系修复重建提供了一种前景良好的手段。
4其它
有研究报道,生物活性因子通过来源于α2-纤溶酶抑制剂的肽段能共价结合至纤维蛋白基质中[40]。因此，Lorentz等[41]将α2-纤溶酶抑制剂的8个氨基酸系列（α2PⅡ-8）结合胰岛素样生长因子-1（IGF-1）的N末端，形成变异体α2PⅡ-8-IGF-1，在凝血酶/XⅢa调控聚合反应时变异体共价结合在纤维蛋白基质中，评估α2PⅡ-8修饰的IGF-1在促进膀胱平滑肌再生中的作用。结果显示，与天然IGF组相比，变异体α2PⅡ-8-IGF-1组更能促进膀胱平滑肌细胞的增殖，表明α2PⅡ-8-IGF/纤维蛋白基质能作为一种IGF的储存体，延长IGF在基质内的储存期，从而提高细胞增殖反应，为促进组织再生提供另一种有效选择。硫酸化氨基聚糖（GAG）通过与外源性生长因子的结合，可以作为生长因子在生物支架中的储存体，增强生长因子在膀胱组织工程中的应用[42-43]。因此，研究GAG与外源性生长因子一起加入生物支架内，以促进组织的再生成为当前的研究热点。Loai等[44]应用透明质酸（HA）与VEGF结合至BAMG中，评估HA-VEGF-BAMG在膀胱组织工程中的作用。在促进膀胱组织再生和血管形成方面，HA-VEGF-BAMG组优于BAMG组和HA-BAMG组、HA-BAMG组优于BAMG组。HA作为GAG家族中的一员，不仅能降低支架的孔隙率和炎症反应，而且具有高黏附性。所以，HA能作为生长因子的载体，有利于促进生长因子在组织再生中的作用。
5问题与展望
综上所述，外源性生长因子通过多种方式保持其持续、缓慢地释放，有效地促进泌尿系组织、器官的再生和血管形成。但目前生长因子可控释放的研究主要集中在短段尿道或部分膀胱修复重建中，尚不能保证这些可控释放方式能满足长段尿道或大面积膀胱缺损的组织再生需要。所以，保证生长因子释放与组织修复的时间一致性尤为重要。同时，目前研究者主要研究单一生长因子在泌尿系组织修复重建中的作用，而正常组织再生往往需要在多种因子的相互作用下完成。所以，具有可以控制多种因子同时或顺序释放的可控性强的纳米和微米载体技术有望成为极具前途的组织工程大面积缺损重建的重要技术。促进外源性生长因子持续、缓慢、高表达的基因治疗手段在泌尿系组织工程修复重建中具有重要的作用，但由于基因治疗本身存在一些问题，如可控性差、致肿瘤性等。所以，基因治疗需要进一步改进。如微囊化基因治疗技术就是一种新的促进移植组织血管化和组织修复重建的手段[45]，但这方面的研究还在探索中，尚需更进一步的研究。
作者：黄建文 徐月敏 单位：上海交通大学医学院附属第六人民医院泌尿外科
