摘要：为了对辽宁省近年发生的新病害———榛子叶斑病病原菌的生物学特性进行系统测定。采用已经鉴定并报道的榛子叶斑病致病菌榛叶点霉（Ｐｈｙｌｌｏｓｔｉｃｔａｃｏｒｙｌｉ）菌株分别置于设定条件下，采用十字交叉法测量菌落直径，分别测定该病原菌菌丝及分生孢子的生物学特性，对该病害的症状及病原菌形态进行描述，并对病菌的生物学特性进行系统测定。病菌菌丝生长以ＰＳＡ培养基最适，能有效利用多种糖和氮源，分别以麦芽糖和甘氨酸最佳，菌丝适宜生长温度为２０～２５℃，最适ｐＨ值为７～９，光照可促进菌丝生长，菌丝致死温度６１℃。病菌分生孢子萌发适宜温度为１５～２５℃，最适ｐＨ值为５，黑暗条件下对孢子更易萌发，分生孢子致死温度５８℃。对病原菌菌丝和分生孢子的生物学特性系统测定结果表明，不同培养条件下，病原菌菌丝生长和分生孢子萌发均表现出明显的差异。
关键词：榛子；叶斑病；榛叶点霉；菌落直径；生长温度；生物学特性
榛子（ＣｏｒｙｌｕｓｈｅｔｅｒｏｐｈｌｌａＦｉｓｃｈｌ）为榛科榛属木本植物的球果，别称平榛、榛、棰子等。榛子为坚果，果形似栗子，红棕色或金黄褐色，并着彩色条纹［１］，广泛分布于东北、华北及陕西、甘肃等地。榛子有“坚果之王”的美称，与扁桃、胡桃、腰果并称“四大坚果”。其坚果营养丰富，用途广泛，经济价值高，是加工各种巧克力、糖果、冰淇淋以及榛子粉和榛子乳等高级营养品的重要原料［２］，还具有消炎、防心血管疾病、增强性功能、养颜护肤、延年益寿和抗衰老的功效［３］。而随着榛子的营养价值和药用价值逐渐被人们重视，种植面积快速增加，随之而来是病害的发生严重。２０１１年８月，笔者在辽宁省瓦房店市炮台镇首次发现榛子叶斑病，随后在辽宁省抚顺章党基地也发现该病的发生。榛子叶斑病由叶点霉属（Ｐｈｙｌｌｏｓｔｉｃｔａ）真菌引起。Ｓａｃｃａｒｄｏ于１８８４年首次对榛子叶斑病进行记载，病原菌为榛叶点霉（Ｐｈｙｌｌｏｓｔｉｃｔａｃｏｒｙｌｉ）［４］。笔者曾对中国辽宁省新见发生的榛子叶部病害进行初步研究，并经柯赫氏法则证病，结合分离菌株的ＩＴＳ序列分析，鉴定其致病菌为榛叶点霉，认为该病害为榛子叶斑病并对其进行了相关报道［５］。园地调查发现，在榛子结果期，高温高湿条件下的榛子叶斑病的发生率显著增加。近年来，病害发生面积呈扩展趋势。榛子叶斑病菌主要危害榛子的叶片，初期在叶片正反两面均产生针尖大小的褐色斑点，随后病斑逐渐扩大，病斑直径３～９ｍｍ，病斑边缘颜色较中间颜色稍浅。严重时叶片干枯脱落，影响产量。湿度大时，病斑上生有小黑点，即为病菌的分生孢子器（图１－Ａ）。利用病菌孢悬液接种榛子叶片后，室温保湿，８～１０ｄ叶片开始表现症状，叶面出现针尖大小褪绿斑，后扩展至圆形至椭圆形褐色病斑（图１－Ｂ），表现症状与园地症状一致。在ＰＤＡ培养基中培养１０ｄ左右，菌落呈灰白色，气生菌丝短而致密；随着培养时间的不断加长，菌落颜色逐渐变深，呈灰黑色，在菌落上产生分生孢子器。分生孢子器球形，深褐色，直径１５０～２０５ｍ（图２－Ａ）。分生孢子单胞，无色，卵圆形至椭圆形，大小在（２．４～４．５）ｍ×（１．６～２．４）ｍ（图２－Ｂ）。本研究针对榛子叶斑病致病菌的生物学特性进行了较为系统的测定，以便进一步为该病害的深入研究提供理论依据。
１材料与方法
１．１病菌菌丝生长测定将纯化的菌株进行活化，在试验设定条件下接种病菌单孢子，２５℃恒温培养，１０ｄ后采用十字交叉法测量菌落直径。每处理５次重复［６］。１．１．１培养基试验选用ＰＤＡ、ＰＳＡ、ＯＡ、玉米粉培养基、水琼脂培养基、Ｒｅｃｈａｒｄ、Ｃｚａｐｅｋ和孟加拉红培养基。１．１．２碳源试验供试碳源为木糖、可溶性淀粉、麦芽糖、葡萄糖、果糖、甘露醇、乳糖、山梨醇，ＰＤＡ为基础培养基，不同碳源等量置换葡萄糖［７］。１．１．３氮源试验供试氮源分别选用蛋白胨、丙氨酸、胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、精氨酸、甲硫氨酸，查氏为基础培养基，不同氮源等量置换ＫＮＯ３。１．１．４温度试验用ＰＤＡ培养基，分别置于５、１０、１５、２０、２５、３０、３５℃不同温度下恒温培养。１．１．５ｐＨ值试验用１ｍｏｌ／ＬＨＣｌ和１ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ将ＰＤＡ培养基ｐＨ值分别调节为３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０、１１．０。１．１．６光照试验采用ＰＤＡ平板培养基，分别置于２４ｈ／ｄ光照条件、１２ｈ光照与１２ｈ黑暗交替、２４ｈ黑暗条件下培养。１．２菌丝致死温度试验将直径为４ｍｍ的菌片移入装有１０ｍＬ无菌水的试管中，再将试管分别置于４０～８０℃（梯度为５℃）９个处理温度的恒温水浴锅中处理１０ｍｉｎ（预热１ｍｉｎ），测得致死温度范围后，以１℃为梯度求得准确的致死温度。试验重复处理５次。１．３分生孢子萌发测定每处理重复５次，培养２４ｈ后每次随机镜检１００个孢子，统计萌发率［６］。１．３．１温度对分生孢子萌发的影响经预备试验后，选用孢子清水萌发法，将分生孢子配成浓度适当的悬浮液，滴于载玻片上，分别置于５、１０、１５、２０、２５、３０、３５℃条件下培养。１．３．２ｐＨ值对分生孢子萌发的影响用磷酸盐缓冲液将分生孢子悬浮液ｐＨ值调配为３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０、１１．０，２５℃恒温培养。１．３．３光照对分生孢子萌发的影响将分生孢子悬浮液滴在载玻片上，分别置于光照、光照与黑暗交替、黑暗条件下，２５℃恒温培养。１．４分生孢子致死温度测定清水配制孢悬液，装入试管中，置于３５～６０℃（梯度为５℃）恒温水浴锅中处理１０ｍｉｎ（预热１ｍｉｎ），测得致死温度范围后，以１℃为梯度求得准确的致死温度。
２结果与分析
２．１环境条件对病菌菌丝生长的影响２．１．１培养基对菌丝生长的影响病菌菌丝在ＰＳＡ培养基中生长最快，其次为ＰＤＡ培养基；在Ｒｅｃｈａｒｄ培养基中生长速度最慢（表１）。从菌落形态和颜色看，病菌在水琼脂中稀疏且菌落呈薄透明状，在其他各培养基中均生长致密，在ＯＡ培养基、玉米粉培养基、ＰＤＡ、ＰＳＡ中菌落呈局部放射状沟痕。２．１．２碳源对菌丝生长的影响病原菌可利用多种糖，在以麦芽糖为碳源的培养基上菌丝生长最快，在以木糖为碳源的培养基上生长最慢（表２）。２．１．３氮源对菌丝生长的影响病菌在不同氮源中生长差异显著，其中尤以甘氨酸、蛋白胨最适合菌丝生长，在含精氨酸的培养基上菌丝几乎不生长（表３）。２．１．４温度对菌丝生长的影响温度对病菌生长影响明显，菌丝在５～３５℃范围内均能扩展，２０～２５℃为最适宜温度。低于５℃或高于３５℃均不利于病菌菌丝生长（图３）２．１．５ｐＨ值对菌丝生长的影响菌丝生长的ｐＨ值范围为３～１１，ｐＨ值３～４范围内，随ｐＨ值增高菌丝生长速度明显加快；ｐＨ值７～９时，菌落生长速度最快，为该菌最适宜生长的ｐＨ值。可见，偏碱性条件有利于菌丝生长（图４）。２．１．６光照对菌丝生长的影响菌丝在光照条件、光暗交替条件下菌落直径分别为６．５０、６．４５ｃｍ显著高于黑暗条件下的４．７７ｃｍ。说明不同光照处理对菌丝生长的影响存在一定差异，光照条件更有利于菌丝生长。２．１．７菌丝致死温度当处理温度达６１℃后，无菌丝生长，表明该菌菌丝致死温度为６１℃。２．２环境条件对分生孢子萌发的影响２．２．１温度对孢子萌发的影响从图５可以看出，温度对分生孢子萌发的影响较大，１５～２５℃为萌发最适温度，２４ｈ萌发率接近８０％，低于１０℃或高于３０℃严重抑制分生孢子的萌发。２．２．２ｐＨ值对孢子萌发的影响病菌分生孢子萌发的ｐＨ值范围为３～１１，最适ｐＨ值为５。ｐＨ值３、１１时，病菌分生孢子萌发率极低（图６）。２．２．３光照对孢子萌发的影响黑暗条件下孢子萌发率为７１．６７％，明显高于光照条件下的３５．４６％和光暗交替条件下的５３．０７％，可见黑暗条件促进孢子萌发。２．２．４分生孢子致死温度测定病菌的分生孢子经≥５８℃的几个温度处理后，均不萌发，表明该菌分生孢子的致死温度为５８℃。
３讨论
Ｓａｃｃａｒｄｏ于１８８４年首次对榛子叶斑病进行记载，确定其２．１．５ｐＨ值对菌丝生长的影响菌丝生长的ｐＨ值范围为３～１１，ｐＨ值３～４范围内，随ｐＨ值增高菌丝生长速度明显加快；ｐＨ值７～９时，菌落生长速度最快，为该菌最适宜生长的ｐＨ值。可见，偏碱性条件有利于菌丝生长（图４）。２．１．６光照对菌丝生长的影响菌丝在光照条件、光暗交替条件下菌落直径分别为６．５０、６．４５ｃｍ显著高于黑暗条件下的４．７７ｃｍ。说明不同光照处理对菌丝生长的影响存在一定差异，光照条件更有利于菌丝生长。２．１．７菌丝致死温度当处理温度达６１℃后，无菌丝生长，表明该菌菌丝致死温度为６１℃。２．２环境条件对分生孢子萌发的影响２．２．１温度对孢子萌发的影响从图５可以看出，温度对分生孢子萌发的影响较大，１５～２５℃为萌发最适温度，２４ｈ萌发率接近８０％，低于１０℃或高于３０℃严重抑制分生孢子的萌发。２．２．２ｐＨ值对孢子萌发的影响病菌分生孢子萌发的ｐＨ值范围为３～１１，最适ｐＨ值为５。ｐＨ值３、１１时，病菌分生孢子萌发率极低（图６）。２．２．３光照对孢子萌发的影响黑暗条件下孢子萌发率为７１．６７％，明显高于光照条件下的３５．４６％和光暗交替条件下的５３．０７％，可见黑暗条件促进孢子萌发。２．２．４分生孢子致死温度测定病菌的分生孢子经≥５８℃的几个温度处理后，均不萌发，表明该菌分生孢子的致死温度为５８℃。
参考文献：
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作者：孙俊 单位：辽宁省经济林研究所
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