1．钙循环与兴奋-收缩耦联
钙离子循环在心肌细胞的兴奋收缩耦联中起着至关重要的作用。心肌细胞兴奋去极化激活L-型钙通道，少量Ca2+迅速内流，胞内钙浓度增高，激活肌浆网上钙释放通道(ryanodinereceptor，ＲyＲ2)，导致肌浆网内贮存的Ca2+释放入胞浆，此过程即钙触发钙释放(calcium-inducedcalciumre-lease，CICＲ)。胞浆中游离钙达到10－5mol/L时，肌钙蛋白被激活，肌钙蛋白的构象改变，肌球蛋白和肌动蛋白接触，引起心肌细胞收缩。肌浆网上的钙泵(sarcoplasmicreticulumcalciumadenodinetriphosphatase，SEＲCA2)将胞浆内游离Ca2+泵回肌浆网贮存，胞浆内游离钙降至10-7mol/L时，肌球蛋白和肌动蛋白分离，心肌舒张。心肌的收缩-舒张过程受到多种因素的调节。受磷蛋白(phospholamban，PLN)是存在于肌浆网纵行小管的膜蛋白，非磷酸化的PLN与SEＲCA2结合，通过蛋白-蛋白之间的相互作用抑制SEＲCA2与Ca2+的亲和力，降低SEＲCA2的活性。环磷酸腺苷(cAMP)依赖性蛋白激酶A(PKA)和Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶(CaMBKⅡ)则使PLN磷酸化，磷酸化的PLN与SEＲCA2解离，消除其抑制作用，活化SEＲCA2。咖啡因、ATP、Na+、K+及磷酸化等都可以刺激ＲyＲ2的开放，而H+、钌红和去磷酸化等则可以抑制ＲyＲ2的开放。FKBP12.6可以稳定ＲyＲ2关闭时的构象状态。S100A1作为一种钙结合蛋白，对Ca2+有很强的结合力，可以调节ＲyＲ2和SEＲCA2的功能以及肌浆网钙含量。β-肾上腺素受体的激活可以增强钙循环，加快心肌收缩和舒张的节律。
2．心力衰竭的基因治疗
心脏收缩-舒张过程中任何一个环节的功能障碍都可能导致心肌的收缩和/或舒张功能降低，从而诱发心力衰竭的产生。心力衰竭的基因治疗靶点即针对此过程中的钙循环相关蛋白和调控因子。基因治疗包括三个基本要素:基因载体、转移方式和靶基因。
(1)基因载体靶基因需要通过特定的载体转移到靶细胞中去，目前常用的基因载体主要分为非病毒载体和病毒载体两大类。非病毒载体可大致分为质粒DNA、脂质体DNA复合物和高分子DNA复合物。寡核苷酸类及其类似物，亦可单独或以复合物的形式作为一种非病毒载体用于基因转移。一种可降解的高分子聚合纳米粒子，具有强大的核酸容量，避免了腺病毒转染有关的安全问题，适合作为基因载体，已得到了美国FDA的批准［3］。病毒载体在临床前研究中应用更为广泛，主要包括腺病毒载体、腺相关病毒载体(AAV)、反转录病毒和慢病毒载体，病毒载体的应用大大提高了基因转移的效率。重组人类腺病毒载体是转基因治疗模型中最常用的载体，它的优势在于:扩增相对容易，可以达到较高的病毒滴度发挥功能，对靶细胞存在尤其是对心血管系统广泛亲嗜性。无论在体内还是体外环境下，绝大部分心肌细胞都可以被腺病毒有效转染。然而，将腺病毒应用于临床仍面临许多挑战。腺病毒进入机体后，可能会引起强烈的免疫和炎症反应，这将限制其后续的表达。病毒可能感染所有的器官(尤其是肝脏)，不能呈现理想的组织选择性。相对于腺病毒，虽然AAV、反转录病毒和慢病毒载体有着较低的免疫原性，但是AAV难以达到高效价的病毒滴度，对靶基因的装载能力有限以及人体本身存在中和抗体等。反转录病毒载体不能转染类似心肌细胞的不分裂细胞，慢病毒的生物安全性尚待评价。
(2)载体转移途径目的基因转移到靶细胞，除了需要适宜的载体，还要有适合的转移途径。一些可增加血管通透性的化学物质曾被用于促进载体从血管腔转移至心肌，如硝酸甘油、硝普钠、5-羟色胺、缓激肽、组胺及血管内皮生长因子等，但是对于临床心力衰竭患者，考虑到以上物质有降低血压的作用，需谨慎应用。常用的转移途径包括:①顺向注射法:一种为阻塞冠状动脉的顺向注射法，即用球囊阻塞冠状动脉近端，使病毒载体不会逆流或被稀释，但此法存在安全隐患，因为即使短时间的冠状动脉阻塞也可能不能耐受;另一种为非阻塞冠状动脉的延长顺向注射法，此法用于AAV的转移最为有效，而且可作为心力衰竭患者不能耐受冠状动脉阻塞法的最佳选择。尽管这种方法并不能感染所有心肌(约60%)，但它更符合冠状动脉的正常生理血流特点。重度心力衰竭患者接受携带SEＲCA2a的AAV1转染的临床研究，即采用了延长顺向注射法。另一种为循环灌注技术，通过经皮的最小微创手术建立心肌的独立灌注区域，使冠状动脉和冠状窦之间形成一个闭合回路，此法在携带SEＲCA2a的腺病毒载体和AAV转染绵羊心力衰竭模型中应用，证实可显著改善心肌收缩力［4］。②逆向注射法:经冠状静脉逆向注射对于有冠状动脉疾病的患者来说是一个非常好的选择。然而，逆向注射法对不能耐受冠状动脉阻塞的患者也存在操作困难。③直接注射法:经过外科手术或经皮介入将载体直接注入到心肌组织，此法可避免许多血管内途径带来的潜在弊端:肝脏和脾脏的首过消除作用、中和抗体的效应、T细胞应答以及血管内皮屏障的不渗透性。直接注射法仅将病毒载体转移至注射部位心肌。④心包腔途径:经由心包将载体转移，载体会优先在心包邻近的心肌细胞中表达。如何最优化心包转移法的治疗效应主要取决于多少比例的靶组织需要被纠正。局灶性的基因转移适于局部缺血的心肌组织，弥散性的基因转移更适于纠正整体的心功能不全。⑤手术转移:通常需对实验动物进行开胸手术，继而采用直接、顺向或逆向注射。然而，临床心力衰竭患者能否耐受此法尚待进一步研究证实。
(3)靶基因理想的靶基因应具备以下特性:在心力衰竭动物模型证实能改善心功能，无致心律失常性，量效关系明确，即靶基因表达越多，心脏功能的改善越明显［5］。如表1所示，迄今用于心力衰竭转基因治疗的靶基因包括［6-18］:钙循环相关蛋白:①过表达SEＲCA2a:早在20余年前，Gwathmey等即发现，无论心力衰竭病因如何均存在明显的钙循环异常，且部分归因于SEＲCA2a的活性下降。大量的心力衰竭动物模型结果显示，过表达SEＲCA2a基因可显著增加心肌收缩功能，在容量负荷过重所致的心力衰竭猪模型，甚至可改善心室重构［6-7］。另外，过表达SEＲCA2a可修复心肌能量供应和利用的失衡，降低室性心律失常发生，增加冠状动脉血流［8，19］。②抑制PLN:抑制PLN的表达，可起到与过表达SEＲCA2a相似的效应，进一步改善心肌的收缩和舒张功能。在起搏诱导的羊心力衰竭模型，通过基因沉默抑制PLN的表达，2周后，即显示PLN抑制组左心室舒张末径显著减小，射血分数显著增加［9］。利用ＲNA干扰技术，将携带抑制PLN表达的基因序列的AAV9，通过静脉注射转染心脏结果显示:PLN蛋白表达下降了75%，SEＲCA2a的活性部分恢复，心力衰竭大鼠的血流动力学特性显著改善，收缩功能、舒张功能各项指标均恢复正常，心室肥厚、心肌纤维化程度均明显下降［10］。③S100A1:S100是一类钙结合蛋白，其中S100A1主要在心脏表达。S100A1参与了对细胞内外Ca2+调控的多个环节，可增加肌浆网SEＲCA2a和ＲyＲ2的活性促进心肌的收缩和舒张，调节细胞膜的顺应性和对Ca2+的反应性，调控Ca2+介导的线粒体的能量代谢［20-21］。在心肌梗死后心力衰竭猪模型，通过冠状静脉逆向转移法，将AAV-S100A1注射至左心室非梗死区结果显示:注射14周后，S100A1治疗组修复了肌浆网的钙循环障碍，抑制了进行性的心功能下降，逆转了左心室重构，且不增加室性心律失常的诱发率，证实了S100A1转基因治疗的长期有效性和安全性［11-12］。β肾上腺素受体(β-AＲ)系统:心力衰竭患者的β-AＲ往往呈现为表达下调。将携带β2-AＲ的腺病毒经冠状动脉转染兔心肌细胞，发现在转染后第1周、3周时，反映心肌收缩力的指标dP/dtmax明显增加，且心肌细胞对β-AＲ激动剂异丙肾上腺素的反应性显著增强［22］。过表达β2-AＲ的小鼠亦显示心脏功能得到明显改善。G蛋白偶联受体激酶(GＲK):β-AＲs与G蛋白之间的相互作用是通过激酶对偶联受体的磷酸化调节作用来实现的。GＲK2是心脏中表达最多的GＲK，它在心力衰竭时表达增加，导致β-AＲ信号通路敏感性下降，功能障碍。在心肌梗死后心力衰竭小鼠模型，选择性的抑制GＲK2表达，结果发现10天后，GＲK2抑制组小鼠生存率增高，心室重构延缓，心肌的收缩力增强［23］。β-AＲKct多肽是GＲK2介导的β-AＲ失敏的抑制剂。将携带β-AＲKct的腺病毒感染心梗后心力衰竭兔，发现转染后3周，心室功能明显改善［16］。β-AＲKct过表达的阳性结果在猪的心力衰竭模型上亦得到验证［17］。腺苷酸环化酶(AC):心肌细胞接受儿茶酚胺刺激，经由β-AＲ使细胞内AC激活，生成cAMP，这是正常的生理反应。分离过表达VI型AC的转基因小鼠心肌细胞，发现cAMP表达增高，心功能增强［24］。在起搏诱导的心力衰竭猪模型，转染携带Ⅵ型AC基因的腺病毒，结果显示可显著改善心脏功能和逆转心室重构，且这种效应与cAMP的生成增多具有明显相关性［18］。
3．心力衰竭基因治疗的临床试验
靶基因在细胞模型、啮齿类动物模型和大动物模型上均得到验证，合适的载体和适宜的转移途径，这些是开展临床试验的前提。诚然临床试验开始前还需要充分评价机体对病毒载体的免疫反应、明确心功能指标的评价标准以及评价罹患心律失常的风险［25］。既往因病毒载体所导致的严重不良事件，如注射重组腺病毒后诱发的多器官衰竭、注射反转录病毒后出现的T细胞淋巴瘤等，限制了基因治疗的发展。随后新的研究进展和新的病毒载体的迅速出现，突破了以上技术瓶颈，为转基因治疗领域带来了新的曙光［26］。心力衰竭转基因治疗第一项临床试验始于2007年，是在美国发起的多中心CUPID(calciumup-regulationbypercu-taneousadministrationofgenetherapyincardiacdisease)研究，旨在评价AAV1-SEＲCA2a基因治疗对晚期心力衰竭患者的安全性及生物学疗效。第一期试验共纳入12例患者，通过冠状动脉内注射给药，四组内的每3例患者均依次增加给药剂量。随访至第12个月时，试验结果显示安全性尚可，41.7%的患者显示症状改善，33.3%显示功能改善，16.7%显示生物标志物改善，50%有左心室功能和重构改善［27］。在二期试验中，共39例晚期心力衰竭患者随机接受AAV1-SEＲCA2a治疗，分为低剂量组、中等剂量组、高剂量组和安慰剂组。在第6个月时，评价患者的症状(NYHA分级、明尼苏达心力衰竭问卷)、功能状态(6分钟步行实验、最大氧耗量)、NT-BNP水平、心脏超声各项指标等。组间和组内患者比较，以上临床指标具有一致性的改善才被认为是试验成功。高剂量AAV1-SEＲCA2a治疗组达到了预设定的成功标准。与安慰剂相比，AAV1-SEＲCA2a治疗的患者显示NYHA分级、明尼苏达心力衰竭评分、6分钟步行实验、最大氧耗量、NT-BNP水平和左心室收缩末期容积得到改善或稳定。所有接受AAV1-SEＲCA2a治疗的患者心血管事件发生率均降低，不良反应、疾病相关事件及心律失常均未见增加［28］。随访至3年，SEＲCA2a基因仍在表达，治疗的临床效果仍然存在［29］。入选250例，以SEＲCA2a为靶基因的CUPID2b期试验(NCT01643330)即将完成［30］。另两项以SEＲCA2a为靶基因的试验也正在进行当中。第一项试验在英国实施，纳入的是在AAV6-SEＲCA2a治疗前接受左心室辅助装置治疗至少1个月的晚期心力衰竭患者。另一项二期临床试验AGENT-HF(AAV6-CMV-Serca2aGENetherapytrialinheartfailure)在法国实施，是一项单中心、双盲、随机、安慰剂对照的平行研究，主要探讨AAV6-CMV-SEＲCA2a治疗对严重心力衰竭患者心脏重构的影响。此外，尚有以AC6、SDF-1为靶基因的临床试验正在进行中。
随着对心力衰竭病理生理机制认识的不断深入，基因治疗技术的不断改进，心力衰竭转基因治疗的临床前研究业已取得了巨大进展，二期临床试验亦证实了其可行性、有效性和安全性。对于部分晚期心力衰竭患者，转基因治疗可成为其彻底挽救心脏功能的根本性治疗策略，期待更理想的靶基因在优质的载体介导下发挥治疗效应，为心力衰竭患黑龙江职称者造福。
作者：姚艳 刘小慧 董建增 单位：首都医科大学附属北京安贞医院 北京市心肺血管疾病研究所
